科研进展-- 干细胞与再生医学创新研究院

王红梅研究组及合作团队利用食蟹猴胚胎体外培养模型揭示灵长类早期神经胚发育特征

研究者建立了一个可支持食蟹猴胚胎体外发育至受精后25天的3D长时程培养体系，并基于该体系探究了灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经发育过程中的核心事件和谱系特征。研究者比较了人类和非人灵长类胚胎2D和3D体外培养体系，对不同体系中胚胎的大小和存活率进行评估。研究者发现，2D和3D体系都能支持胚胎发育到d.p.f. 20。在2D体系下，胚胎由于胚外组织发育旺盛而迅速增大，但内部的胚体发育并不好。而在3D体系下，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体结构显著发育。这些特征提示2D体系优先支持胚外组织生长，而胚外组织的过度生长可能限制了胚体本身的发育。为了保证胚体的发育，研究者继续优化3D体系。已报道的人类胚胎M-3D体系需要在d.p.f. 9-14的培养基中连续添加Matrigel，以模拟人类胚胎植入后环境。鉴于食蟹猴胚胎植入子宫比人类胚胎浅表，因此，研究者仅在d.p.f. 10-12的培养基中加入Matrigel。优化后的体系能支持33.7%（n = 91）的食蟹猴胚胎发育到d.p.f. 25，该体系被命名为3D长时程培养体系　　出生缺陷严重影响国民健康。有数据显示，当前已知的出生缺陷病种超过8000种，其中神经管畸形是常见的一类出生缺陷。出生缺陷的发生与早期胚胎发育异常直接相关。因此，研究早期胚胎发育过程、探究发育机理，是揭示病理性胚胎发生机制，提升相关疾病诊疗效率，从根源上提高人民健康水平的重要前提。　　人早期胚胎发育起始于受精卵（胚胎期第0天；day post-fertilization 0；d.p.f. 0）。受精卵经过数次卵裂形成囊胚，囊胚于d.p.f. 7左右种植入母体子宫并进一步发育，于d.p.f. 14启动原肠运动。原肠运动是早期胚胎发育过程中的里程碑事件，在此过程中，胚胎细胞发生大规模分化、迁移和重排，并形成外、中、内三胚层和体轴。外胚层于d.p.f. 20左右进一步发育形成位于中间的神经板（也称为神经外胚层）、位于两侧的表皮外胚层和位于两者之间的神经板边缘。神经板弯曲、折叠、增厚并进一步闭合，形成神经管。闭合的神经管沿胚胎背腹轴分化出不同的神经祖细胞。神经管形成的过程称为神经胚形成。中、内胚层进一步发育出体节、心脏、肠管等早期器官的原基，胚胎自此进入更加复杂的器官发育阶段。由于人早期胚胎样品极难获取，以上事件在人类胚胎中无法被直接探究和揭示。　　胚胎体外培养技术为探究人类胚胎早期发育提供了有力武器。借此，人d.p.f. 14之前的发育事件已被初步揭示1-4。但人类胚胎体外研究存在必须在d.p.f. 14终止的伦理限制。因此，体外培养的人类胚胎不能被用于研究d.p.f. 14之后的原肠运动和早期神经胚发育等事件。非人灵长类与人类在进化上和发育生物学特征上高度相似，是研究人早期胚胎发育的理想模型。因此，搭建非人灵长类胚胎体外培养体系，揭示非人灵长类胚胎发育特征，将极大提升我们对包括人类在内的灵长类早期胚胎发育及相关疾病的认识。1995年，澳大利亚科学家将绒猴的囊胚体外培养至d.p.f. 11，用于研究灵长类动物胚胎植入后发育5。2019年，王红梅团队及国内外同行将食蟹猴胚胎体外培养至d.p.f. 20，探究了灵长类早期原肠运动特征6,7。那么，灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经胚发育有哪些特征？是否可以延长食蟹猴胚胎体外发育历程，以进一步探究灵长类胚胎发育特征？这些问题一直是发育生物学领域前沿热点问题。　　为了回答以上科学问题，研究者建立了一个可支持食蟹猴胚胎体外发育至受精后25天的3D长时程培养体系，并基于该体系探究了灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经发育过程中的核心事件和谱系特征。研究者比较了人类和非人灵长类胚胎2D（2D Ibidi μ-plates和2D coated with Matrigel, Ibidi-2D和M-2D）和3D（3D low-adhesion 96-well with Matrigel, M-3D）体外培养体系1,6,7，对不同体系中胚胎的大小和存活率进行评估。研究者发现，2D和3D体系都能支持胚胎发育到d.p.f. 20。在2D体系下，胚胎由于胚外组织发育旺盛而迅速增大，但内部的胚体发育并不好。而在3D体系下，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体结构显著发育。这些特征提示2D体系优先支持胚外组织生长，而胚外组织的过度生长可能限制了胚体本身的发育。为了保证胚体的发育，研究者继续优化3D体系。已报道的人类胚胎M-3D体系需要在d.p.f. 9-14的培养基中连续添加Matrigel，以模拟人类胚胎植入后环境1。鉴于食蟹猴胚胎植入子宫比人类胚胎浅表，因此，研究者仅在d.p.f. 10-12的培养基中加入Matrigel。优化后的体系能支持33.7%（n = 91）的食蟹猴胚胎发育到d.p.f. 25，该体系被命名为3D长时程培养体系（prolonged in vitro culture，pIVC；图1）。　　为了探究灵长类早期神经胚发育过程，研究者首先对神经系统发育关键调控因子进行鉴定。首先，d.p.f. 20-22胚胎的胚体背侧中部可检测到OTX2+/OCT4+或OTX2+/SOX2+的细胞，提示OTX2的表达与外胚层细胞分化密切相关。PAX3和PAX6表达于d.p.f. 22-25的外胚层细胞，表明此时神经外胚层的特化。在d.p.f. 24-25的胚胎中可检测到神经外胚层闭合的区域，提示神经管形成。另外，OTX2、PAX8和NKX2.2阳性细胞分布于神经管的前部、中部和后部，提示此时的胚胎已有前脑、中脑和后脑/脊髓的区域化。结合神经管的形态特征，研究者发现胚胎前部神经管未闭合，后部神经管已闭合。未闭合和已闭合的神经管都表达N-CAD，而不表达E-CAD，表明胚胎在神经管闭合之前已完成E-CAD向N-CAD的转变。这些pIVC胚胎的神经管形态和分子表达特征与体内相同发育阶段的胚胎相似（图2）。伴随神经外胚层的发育，表皮和神经板边缘的发育同步进行。荧光染色结果显示，d.p.f. 22-25的胚胎已分化出TFAP2A+/E-CAD+的表皮细胞。在未闭合的神经板两侧和闭合的神经管两侧存在PAX3+/SOX9+/SLUG+细胞，标志着神经板边缘和其分化的神经嵴细胞的发育。　　为了探究闭合的神经管细胞是否具有沿背腹轴不对称分化的模式，研究者对d.p.f. 25胚胎的神经管进行鉴定。发现在闭合的神经管背侧存在PAX3阳性细胞、腹侧存在FOXA2和NKX6.1阳性细胞，表明神经管顶板（roof plate）和底板（floor plate）的特化。此外，β-tubulin Ⅲ+/OLIG2+细胞标志着运动神经元祖细胞（progenitors of motor neurons）的特化；NKX2.2+/FOXA2+细胞标志着腹侧中间神经元祖细胞（progenitors of ventral interneuron 3）的特化。与闭合的神经管相比，OLIG2和NKX2.2未能在未闭合的神经管中检测到。这些分子表达特征与体内对应阶段胚胎的特征一致，表明pIVC胚胎可重现神经管沿背腹轴区域化发育的模式（图3）。　　除外胚层和神经管发育外，研究者还检测了pIVC胚胎中原始生殖细胞（primordial germ cells）和中、内胚层的发育特征。荧光染色结果显示，SOX17+/TFAP2C+/BLIMP1+细胞可在d.p.f. 22-24的胚胎后部腹侧被检测到，提示pIVC胚胎可发育出原始生殖细胞样细胞。在胚胎腹侧的位置还可检测到T+/CDX2+/OCT4+/Low或T+/TBX6+/SOX2-细胞，表明pIVC胚胎可发育出原条及其分化产物。此外，T+/TBX6+/SOX2+细胞的出现提示胚体存在类神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitor）或前体节中胚层细胞（presomitic mesoderm）的特化。另外，研究者可在pIVC胚胎的单细胞转录组数据中检测到MYL7、NKX2-5、HAND1和GATA4共表达的细胞，提示pIVC胚胎或存在心脏中胚层样细胞。单细胞多组学和荧光染色结果提示pIVC胚胎中可检测到OTX2+/FOXA2+/SOX17+细胞，表明胚胎已分化出定型内胚层（definitive endoderm）和卵黄囊（yolk sac）。与相同发育阶段的体内正常胚胎相比，pIVC胚胎的这些分子表达特征与正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重现原肠运动中晚期阶段中胚层和内胚层的发育。　　研究者进一步利用单细胞多组学测序技术（单细胞转录组、DNA甲基化和染色质可及性测序，scChaRM-seq）8，对9个pIVC胚胎的3,850个单细胞的转录组和1,862个单细胞的DNA甲基化和染色质可及性进行测序和分析。结果提示，与本团队2022年在Nature杂志报道的相同发育阶段的食蟹猴胚胎单细胞转录组数据库相比9，pIVC胚胎可重现体内正常胚胎的转录组特征。DNA甲基化分析提示，pIVC胚胎各种细胞类型的基因均发生了甲基化，且胚胎组织的DNA甲基化水平（~75%）高于胚外组织（~50%），这与已报道的小鼠和人类胚胎特征相似2,10。　　综上所述，本研究建立了可支持食蟹猴胚胎体外发育至d.p.f. 25的3D pIVC体系，基于该体系揭示了灵长类胚胎中晚期原肠运动至早期神经胚发育阶段胚胎的形态、细胞组分、转录组、DNA甲基化和染色质可及性等特征。该研究为深入了解人类早期胚胎发育机制，以及早期胚胎发育异常相关疾病的病理研究提供了技术平台。　　本研究工作于2023年5月11日以封面文章形式发表于Cell，题为“Neurulation of the cynomolgus monkey embryo achieved from 3D blastocyst culture”。中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院王红梅研究员、美国宾夕法尼亚大学Nicolas Plachta教授、中国科学院动物研究所郭帆研究员和李伟研究员为该文共同通讯作者。中国科学院动物研究所副研究员翟晶磊、博士研究生徐艳红、助理研究员万海峰、博士研究生燕蕊、博士研究生郭敬以及美国宾夕法尼亚大学博士后Robin Skory为该文的共同第一作者。　　文章链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00415-4　　参考文献：　　1 Xiang, L. et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature 577, 537-542, doi:10.1038/s41586-019-1875-y (2020).　　2 Zhou, F. et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature 572, 660-664, doi:10.1038/s41586-019-1500-0 (2019).　　3 Shahbazi, M. N. et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nat Cell Biol 18, 700-708, doi:10.1038/ncb3347 (2016).　　4 Deglincerti, A. et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature 533, 251-254, doi:10.1038/nature17948 (2016).　　5 A. Lopata, D. J. K., L.G. Bowes, AND W.B. Watkins. Culture of Marmoset Blastocysts on Matrigel: A Model of Differentiation During the Implantation Period. THE ANATOMICAL RECORD 241, 469-486 (1995).　　6 Ma, H. et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science 366, doi:10.1126/science.aax7890 (2019).　　7 Niu, Y. et al. Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture. Science 366, doi:10.1126/science.aaw5754 (2019).　　8 Yan, R. et al. Decoding dynamic epigenetic landscapes in human oocytes using single-cell multi-omics sequencing. Cell Stem Cell 28, 1641-1656 e1647, doi:10.1016/j.stem.2021.04.012 (2021).　　9 Zhai, J. et al. Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution. Nature 612, 732-738, doi:10.1038/s41586-022-05526-y (2022).　　10 Argelaguet, R. et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature 576, 487-491, doi:10.1038/s41586-019-1图1. 能够支持食蟹猴胚胎体外发育至d.p.f. 25的3D长时程培养体系图 2. pIVC胚胎神经外胚层和神经嵴的特化图3. pIVC胚胎神经管细胞的特化

2023-05-12

合作发布国际首个衰老研究伦理治理框架

2023年4月27日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组与中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院“致一”研究员彭耀进合作，在Trends in Molecular Medicine杂志在线发表题为“Acting on ethics and governance of aging research”的政策论文。这是衰老研究团队与科技治理研究团队共同探究前沿科技发展与伦理治理的典范，首次在国际范围内提出针对衰老研究伦理治理框架与策略。　　在过去的30年中，衰老研究取得了显著进展，已进入一个独特的新阶段。衰老研究正在从探索衰老的症状发展到揭示衰老表型的潜在机制，并开始深入探究一系列潜在的衰老干预策略，如药物干预、基因治疗、再生医学、免疫干预和主动健康。一些干预措施已经进入临床试验阶段。此外，基因组测序和数据科学等研究工具和方法的发展，推动衰老研究成为生物医学领域的重要焦点之一。人类健康需求与科技融合发展，共同推动着衰老研究新时代的到来。　　衰老研究具有巨大潜力，衰老干预技术和产品得到了迅速推进。然而，衰老研究及临床转化也面临诸多紧迫且棘手的社会和伦理问题。如果不能及时妥善解决这些问题，可能导致意想不到的制度和社会后果，从而阻碍衰老研究领域的可持续发展。积极的风险评估、提高透明度及更好的治理框架对于行业的健康发展推进意义重大。　　2023年4月27日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组与中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院“致一”研究员彭耀进合作，在Trends in Molecular Medicine杂志在线发表题为“Acting on ethics and governance of aging research”的政策论文。这是衰老研究团队与科技治理研究团队共同探究前沿科技发展与伦理治理的典范，首次在国际范围内提出针对衰老研究伦理治理框架与策略。　　研究人员基于对衰老研究的深入理解，在探索衰老研究的发展需求、内生驱动力及技术趋势的基础上，从三个维度系统阐释重要的伦理和社会问题：衰老研究技术本身、哲学层面的思辨以及特定性的伦理和社会关注。在科学技术层面，尤其是当前衰老研究尚处于早期阶段，如衰老干预的本质、干预的最佳周期、频率和适用性等诸多科学问题还未得到充分解决，这些问题不可避免地会影响伦理和社会考量。不确定性也为相关伦理和社会关注增加了复杂性。在形而上学问题上，诸如延长人类寿命在伦理上是否必要或可接受，干预衰老是否合乎道德，衰老研究是否挑战衰老的必然性等，这些问题因文化、社会和宗教因素而异，争议较大。特定性伦理和社会关注包括老年临床研究参与者的特殊保护、衰老研究技术成果过早商业化以及行业虚假和误导性宣传等问题。同时，衰老干预措施可能产生潜在人口、经济和社会文化影响。　　该研究系统性地构建了全球性的衰老研究伦理治理框架，以促进人类健康的发展。首先，研究人员提出将衰老“审视”为一种“疾病”，有助于培养长期的社会发展观，而不仅仅是关注衰老作为生命退化过程的科学观点。基于此理解，该研究建议将尊重生命，尊重自主性、风险与受益的平衡、公平与公正、透明与合作等基本纳入各法域衰老研究治理框架的监管结构和过程。坚持这些原则将有助于降低风险，并促进快速发展的衰老研究领域的潜在效益。在治理框架设计方面，研究人员强调临床转化的长远发展，适当的立法与规制对衰老研究至关重要，科学界和产业界的自我监管与负责任创新也是关键因素。此外，还需要与公众进行良好的沟通与科普。这些方面均是从衰老研究与干预措施应用角度切入，为衰老研究相关伦理和社会问题的防治提供了新的策略，对衰老基础研究和转化医学领域具有重要理论和实践价值。　　综上，这项研究关注的是衰老领域中经常被忽视的伦理与社会问题，立足于技术发展前沿，对领域内现存问题及潜在风险进行深入剖析，最终构建一个兼具平衡性、包容性与针对性的，且可以根据各个国家与地区不同情况而进行调整的全球性治理框架。随着新技术的出现，如涉及纳米机器人和增强组织再生的器官修复技术、器官制造和移植，以及遗传和表观遗传学干预，衰老研究相关的伦理和社会考量将变得更为复杂。该研究所构建的治理框架仅是一个开始。基于该框架，研究人员希望能够推动全球衰老研究领域的生物学、医学、法学、伦理学等专家学者，政策制定者、监管者以及公众，足够重视相关问题，并前瞻性思考提前做好应对举措，从而推动衰老研究的高质量、可持续发展，最终惠及人类社会。　　通过深入探讨伦理和治理问题，这篇政策论文为衰老科学领域树立了一个伦理治理的典范。在全球范围内，这一伦理治理框架将有助于提高衰老研究的社会认知度，促进多学科、多领域的合作与交流，为应对衰老研究中的伦理与社会挑战、共建人类卫生健康共同体提供支持和保障。　　　该研究由中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院、中国科学院干细胞与再生医学创新研究院、北京理工大学、中国衰老标志物研究联合体等合作完成。中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院研究员宋默识、博士后丁璐璐,北京理工大学肖振宇教授为文章的并列第一作者。中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院研究员刘光慧、“致一”研究员彭耀进为文章的共同通讯作者。　　文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1471491423000643图1：衰老研究的伦理负责任治理框架

2023-05-04

干细胞院合作揭示调控灵长类器官衰老的表观转录组机制

2023年4月6日，中国科学院动物研究所刘光慧研究组、曲静研究组联合中国科学院北京基因组研究所慈维敏研究组以及张维绮研究组在Nature Aging杂志在线发表了题为“m6A epitranscriptomic regulation of tissue homeostasis during primate aging”的研究论文。该研究利用非人灵长类动物（食蟹猴）生理性衰老的多器官研究模型，同时结合基于基因编辑和人类干细胞定向分化的研究体系，通过系统绘制器官和细胞衰老过程中RNA m6A修饰的动态图谱，解析了RNA甲基化修饰及相关基因表达稳态的变化规律，并深入阐释了METTL3–m6A–NPNT通路调控骨骼肌衰老的新型机制。　　m6A是目前已知的真核细胞mRNA上最为常见的一类化学修饰，它的建立、读取和擦除分别受到相应甲基化酶（writer）、结合蛋白（reader）以及去甲基化酶（eraser）的动态可逆调控。研究表明，m6A能够通过调节mRNA的剪接、出核、稳定性以及翻译等生命周期活动，参与调控机体的诸多生理或病理进程，包括胚胎发育、肿瘤以及神经退行性疾病的发生等。然而，在生理性衰老过程中，m6A对于器官稳态维持的调控作用以及关键分子机制均有待阐明。　　2023年4月6日，中国科学院动物研究所刘光慧研究组、曲静研究组联合中国科学院北京基因组研究所慈维敏研究组以及张维绮研究组在Nature Aging杂志在线发表了题为“m6A epitranscriptomic regulation of tissue homeostasis during primate aging”的研究论文。该研究利用非人灵长类动物（食蟹猴）生理性衰老的多器官研究模型，同时结合基于基因编辑和人类干细胞定向分化的研究体系，通过系统绘制器官和细胞衰老过程中RNA m6A修饰的动态图谱，解析了RNA甲基化修饰及相关基因表达稳态的变化规律，并深入阐释了METTL3–m6A–NPNT通路调控骨骼肌衰老的新型机制。　　在这项工作中，研究人员通过对年轻和年老食蟹猴的肝脏、骨骼肌和心脏进行系统的组织学分析发现，脂肪蓄积增加、炎症因子上调以及核纤层蛋白Lamin B1下调是三种组织衰老的共性特征；此外还发现骨骼肌中的凋亡细胞增加、肌纤维萎缩、以及心脏中的心肌纤维肥大等组织特异的衰老相关退行性变化。随后，通过联合分析三种组织的m6A表观修饰图谱及相应的转录组图谱，研究人员揭示了m6A修饰和基因表达稳态之间的相关性以及不同组织共性和特性的衰老调控规律。相较于肝脏和心脏，研究人员在骨骼肌中特异性地检测到了整体m6A修饰的减少以及核心甲基化酶METTL3表达水平的降低。进而通过CRIPSR/Cas9技术，研究人员建立了由人类胚胎干细胞衍生的METTL3敲除的肌管细胞，发现METTL3的缺失导致肌管细胞发生萎缩、凋亡以及加速衰老等退行性变化，与衰老骨骼肌的表型一致。进一步的机制研究揭示了NPNT作为METTL3的下游效应因子发挥维持骨骼肌细胞稳态的作用，而慢病毒载体介导的METTL3或NPNT回补表达均能一定程度上延缓人类肌管细胞的衰老。最后，通过METTL3酶活抑制剂处理以及METTL3酶活突变体过表达等相关实验，研究人员证实了METTL3通过m6A催化活性依赖的方式促进NPNT的表达以及维持肌管细胞的稳态，并且发现m6A结合蛋白IGF2BP1可以结合并稳定受到m6A修饰的NPNT mRNA。　　综上所述，该研究系统揭示了三种重要的灵长类器官/组织在生理性衰老过程中的动态m6A修饰变化及其与基因表达稳态的关系，并且深入阐明了METTL3–m6A–NPNT通路维持人类骨骼肌稳态的作用和机制。研究深化了人们对m6A参与维持人类器官功能稳态的认识以及对衰老的表观转录调控机理的理解，为研究骨骼肌衰老提供了一个有效整合灵长类器官模型和人类干细胞衍生物体系的系统性平台，同时也为延缓骨骼肌衰老或治疗与年龄相关的骨骼肌退行疾病（如肌少症）提供了潜在的分子靶标和干预策略。　　该工作由中国科学院动物研究所、中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）、中国科学院干细胞与再生医学创新研究院、首都医科大学宣武医院等多家机构合作完成。中国科学院动物研究所刘光慧研究员、中国科学院北京基因组研究所慈维敏研究员和张维绮研究员、以及中国科学院动物研究所曲静研究员为文章的共同通讯作者。中国科学院动物研究所特别研究助理武泽明、中国科学院北京基因组研究所博士研究生路明明、中国科学院动物研究所硕士研究生刘迪、中国科学院北京基因组研究所史悦副研究员、任捷研究员以及首都医科大学宣武医院王思研究员为文章的并列第一作者。该研究同时得到了中国科学院北京基因组研究所杨运桂研究员、肖景发研究员以及中国科学院动物研究所魏妥研究员的合作与支持，并获得了国家科技部、国家自然科学基金委和中国科学院等项目的大力资助。　　原文链接：https://doi.org/10.1038/s43587-023-00393-2图1：METTL3-m6A-NPNT通路调控灵长类骨骼肌衰老图2. METTL3通过RNA m6A修饰调控衰老

2023-04-10

刘峰研究组合作研究阐明胞质内多聚腺苷酸化调控造血干祖细胞发育的机制

近日，中国科学院动物研究所、干细胞与再生医学研究院刘峰研究组和中国科学院北京基因组研究所杨运桂课题组合作在PNAS杂志上发表了题为 “Cpeb1b-mediated cytoplasmic polyadenylation of shha mRNA modulates zebrafish definitive hematopoiesis” 的研究论文，揭示了胞质多聚腺苷酸化调控斑马鱼HSPC发育的机制。　　在脊椎动物胚胎发育过程中，次级造血(definitive hematopoiesis)过程可以产生造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC), 而HSPC具有产生所有谱系的血细胞和维持机体终生血液系统的能力 [1]。在次级造血时期，哺乳动物主动脉-性腺-中肾区或斑马鱼背主动脉腹侧壁区域中的一部分内皮细胞接受细胞内、外信号，获得造血潜能，成为生血内皮细胞。这些生血内皮细胞逐渐改变自身形态，由扁平变为球形，并从背主动脉脱离出来最终转变为HSPC [1]。但是，这些内皮细胞如何被精确调控以进行内皮-造血的命运转变仍未完全探究清楚。　　转录后调控，包括选择性剪接 [2]、RNA修饰 [3]、miRNA调节 [4] 以及RNA二级结构 [5, 6] 等，通过控制RNA分子代谢，在信号通路精确调控及细胞命运决定中起着至关重要的作用。胞质多聚腺苷酸化作为转录后调控之一，主要由CPEB家族蛋白调控。CPEB特异性地与靶mRNA的3′非翻译区(3' untranslated region, UTR)富含U的胞质多聚腺苷酸化元件(cytoplasmic polyadenylation element, CPE)结合,并通过组装胞质加尾复合物来促进多聚腺苷酸化和翻译起始 [7]。CPEB家族蛋白参与多种生物学过程的调控，包括突触可塑性、生殖细胞特化、细胞衰老和肌肉干细胞激活等 [8]。据血液疾病相关研究报道，CPEB1在多发性骨髓瘤细胞中的表达显著降低，提示其可能与骨髓瘤的进展有关 [9]。此外，在霍奇金淋巴瘤来源的细胞系中，CPEB1介导的多聚腺苷酸化参与了恶性肿瘤相关基因的调控 [10]。然而，CPEB家族蛋白和胞质多聚腺苷酸化是否在脊椎动物HSPC发育过程中发挥作用尚不清楚。　　近日，中国科学院动物研究所、干细胞与再生医学研究院刘峰研究组和中国科学院北京基因组研究所杨运桂课题组合作在PNAS杂志上发表了题为 “Cpeb1b-mediated cytoplasmic polyadenylation of shha mRNA modulates zebrafish definitive hematopoiesis” 的研究论文，揭示了胞质多聚腺苷酸化调控斑马鱼HSPC发育的机制。　　该研究团队发现在斑马鱼胚胎发育过程中cpeb1b在脊索区域高表达，双荧光原位杂交显示其与脊索特异性表达基因shha具有共定位。随后一系列表型分析实验显示Cpeb1b缺失导致次级造血过程中HSPC的产生减少，并且HSPC减少是由生血内皮细胞特化缺陷导致。为了进一步研究Cpeb1b的造血调控机制，团队收集了不同发育时期的野生型和cpeb1b突变体胚胎进行RNA-seq分析。GO (gene ontology)分析显示在Cpeb1b缺陷胚胎中，已知参与HSPC发育调控的关键信号通路Hedgehog发生了下调。结合后续生化分析，证实了Cpeb1b缺陷导致Hedgehog通路活性抑制，并进一步导致Hedgehog-Vegf-Notch 信号轴下调，最终造成HSPC的产生减少。　　团队进一步通过组学及生化实验研究该表型的分子机制。RNA immunoprecipitation (RIP)-seq和RIP-qPCR实验结果显示Cpeb1b结合Hedgehog通路关键配体shha的mRNA。序列分析显示，shha mRNA的3' UTR含有经典的CPE motif。通过凝胶电泳阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)及体外/体内的CPE motif探针pull-down实验发现，Cpeb1b能结合野生型CPE motif探针而非motif序列突变的探针，证明了Cpeb1b与shha mRNA的特异性相互作用依赖于CPE motif。　　通过观察荧光标记的Cpeb1b、shha mRNA和非典型poly(A)聚合酶Tent2亚细胞定位发现，这些分子共同形成胞质内的凝聚物，并且不同凝聚物可以发生融合。光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)实验显示这些凝聚物中的分子可以扩散并与周围的溶液进行交换，进一步证明了凝聚物的类液体特性，团队因此推测此凝聚物由液-液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)产生。后续分析发现，虽然Cpeb1b自身无法发生相分离，但此凝聚物中含有能发生相分离的Pabpc1b蛋白，Cpeb1b可以通过促进Pabpc1b蛋白相分离来形成大量凝聚物。然而，此凝聚现象的具体作用和详细分子机制还有待进一步阐明。　　团队提取了细胞质RNA作为材料并通过PAT (PCR poly(A) test)实验探究Cpeb1b是否调控早期发育过程中胞质内shha mRNA的多聚腺苷酸化。结果显示与野生型相比，cpeb1b突变体中shha mRNA的poly(A)长度明显更短；作为对照的非Cpeb1b靶标rps18 mRNA的poly(A)长度在野生型和突变体组之间没有差异。由此证明，Cpeb1b参与调控shha mRNA的胞质多聚腺苷酸化。通过核糖体图谱分析(ribosome profiling)发现，与野生型相比，cpeb1b突变体中shha mRNA的翻译效率更低。蛋白印迹分析显示cpeb1b突变体中Shha蛋白水平也出现下降。因此，Cpeb1b通过多聚腺苷酸化来调控shha mRNA的翻译效率。　　综上所述，该研究发现在斑马鱼早期胚胎发育过程中，Cpeb1b介导的shha mRNA胞质多聚腺苷酸化能增强其翻译效率，从而提高Shha蛋白水平。Shha蛋白通过激活Hedgehog-Vegf-Notch信号轴来促进生血内皮细胞的特化，进而维持正常的HSPC产生过程。这些发现为解析信号通路如何被精确调控并指导内皮细胞进行内皮-造血的命运转变提供新的线索。　　该研究由中国科学院动物研究所刘峰研究组和中国科学院北京基因组研究所杨运桂课题组合作完成，西南大学罗凌飞教授和中国医学科学院天津血液所王璐研究员给予重要指导和帮助。该研究得到科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委重点项目以及中国科学院先导专项的资助。　　原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2212212120　　参考文献：　　[1] ORKIN S H, ZON L I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology [J]. Cell, 2008, 132(4): 631-44.　　[2] KOMENO Y, HUANG Y J, QIU J, et al. SRSF2 Is Essential for Hematopoiesis, and Its Myelodysplastic Syndrome-Related Mutations Dysregulate Alternative Pre-mRNA Splicing [J]. Mol Cell Biol, 2015, 35(17): 3071-82.　　[3] ZHANG C, CHEN Y, SUN B, et al. m(6)A modulates haematopoietic stem and progenitor cell specification [J]. Nature, 2017, 549(7671): 273-6.　　[4] LU X, LI X, HE Q, et al. miR-142-3p regulates the formation and differentiation of hematopoietic stem cells in vertebrates [J]. Cell Res, 2013, 23(12): 1356-68.　　[5] SHI B, ZHANG J, HENG J, et al. RNA structural dynamics regulate early embryogenesis through controlling transcriptome fate and function [J]. Genome Biol, 2020, 21(1): 120.　　[6] SHI B, HENG J, ZHOU J Y, et al. Phase separation of Ddx3xb helicase regulates maternal-to-zygotic transition in zebrafish [J]. Cell Res, 2022, 32(8): 715-28.　　[7] RICHTER J D. CPEB: a life in translation [J]. Trends Biochem Sci, 2007, 32(6): 279-85.　　[8] ZENG W, YUE L, LAM K S W, et al. CPEB1 directs muscle stem cell activation by reprogramming the translational landscape [J]. Nat Commun, 2022, 13(1): 947.　　[9] HELLER G, SCHMIDT W M, ZIEGLER B, et al. Genome-wide transcriptional response to 5-aza-2'-deoxycytidine and trichostatin a in multiple myeloma cells [J]. Cancer Res, 2008, 68(1): 44-54.　　[10] BAVA F A, ELISCOVICH C, FERREIRA P G, et al. CPEB1 coordinates alternative 3'-UTR formation with translational regulation [J]. Nature, 2013, 495(7439): 121-5.图1 文章标题图2 Cpeb1b介导的shha mRNA胞质多聚腺苷酸化调控斑马鱼HSPC发育的机制示意图

2023-02-08

干细胞院合作揭示人类基因组古病毒复活驱动衰老

2023年1月6日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、曲静研究组和中国科学院北京基因组研究所张维绮课题组合作在Cell杂志在线发表题为Resurrection of endogenous retroviruses during aging reinforces senescence的研究论文。该研究首次发现了年轻的ERV亚家族在细胞衰老过程中被再度唤醒，提出了古病毒复活介导衰老程序化及传染性的理论，并且创新性地发展出阻断ERV古病毒复活及扩散以实现延缓衰老的多维干预策略。　　病毒与人类之间的协同进化关系源远流长，它们之间的交锋从未随时间停止过。在这场旷日持久的战争中，一方面，病毒使人类饱受疾病困扰，甚至死亡，并在此过程中对人类基因组不断地利用与改造；另一方面，人类的免疫系统会积极对抗病毒的入侵，使得整合到人类基因组中的病毒序列逐渐被宿主细胞的遗传调控系统接管，协同进化。内源性逆转录病毒（Endogenous Retrovirus, ERV）是数百万年前远古逆转录病毒入侵整合到人类基因组的遗迹——“古病毒化石”。在漫长的岁月中，大量ERV的遗传信息被人类细胞俘获，并经过突变、缺失等变异成为人类基因组中的“暗物质”潜伏下来，占据了人类基因组序列的8%左右，成为重要的基因记忆。人类与ERV可谓“魔高一尺道高一丈”，然而在生命的孕育及演化中又貌似呈现出和谐共生的景象。　　衰老是人类慢性疾病的最大危险因素。细胞衰老是机体衰老及各种衰老相关疾病发生发展的重要诱因，表观遗传的程序化改变被认为是决定细胞衰老进程的关键因素。人类基因组潜藏着诸多“老化”信号，这些衰老信息流通常受到表观遗传的严密调控而处于沉默状态，但在增龄过程中，由于表观遗传的失序，这些“老化”信号逃离管控，进而激活启动细胞内的一系列衰老程序。然而，占据人类基因组序列较大比例、如“死火山”般沉寂的ERV古病毒元件是否参与了衰老的程序化调控尚且未知。沉睡在人类基因组中的ERV元件能否在衰老过程中逃脱宿主的监视而被再度唤醒？这些“死火山”的苏醒与爆发对细胞和组织的衰老有何影响？ERV古病毒的复活能否作为度量人类生物学年龄的标志物以及干预衰老的分子靶标？这些关键科学问题亟待解决。　　2023年1月6日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、曲静研究组和中国科学院北京基因组研究所张维绮课题组合作在Cell杂志在线发表题为Resurrection of endogenous retroviruses during aging reinforces senescence的研究论文。该研究首次发现了年轻的ERV亚家族在细胞衰老过程中被再度唤醒，提出了古病毒复活介导衰老程序化及传染性的理论，并且创新性地发展出阻断ERV古病毒复活及扩散以实现延缓衰老的多维干预策略。　　研究人员利用团队建立的不同衰老研究体系（包括儿童早衰综合征、成年早衰综合征、复制性衰老、生理性衰老的人间充质干细胞模型，人成纤维细胞衰老模型，以及小鼠、猴和人的生理性及病理性多器官衰老模型），结合高通量链特异性转录本测序、全基因组DNA甲基化测序、高分辨率单分子RNA/DNA原位杂交、免疫电镜和高灵敏的液滴数字PCR等多学科交叉技术，发现衰老细胞中表观遗传去抑制（如异染色质减少）导致基因组中ERV的转录激活并翻译出病毒蛋白，进而包装成为病毒颗粒。一方面，衰老细胞中ERV的反转录产物通过激活cGAS-STING天然免疫通路诱发细胞衰老和炎症；另一方面，衰老细胞释放的ERV病毒颗粒可通过旁分泌或体液介导的方式在器官、组织、细胞间有效传递并放大衰老信号，最终使得年轻细胞因受“感染”而老化。深入的机制研究表明，ERV反转录产物在宿主细胞胞浆中的出现，会激活初始细胞及被感染细胞中固有的病毒防御机制。这种本能的细胞抗病毒反应意在降低病毒的损害，然而事与愿违，这些防御性机制却恰恰促进了细胞的早衰。研究人员详细阐释了衰老细胞基因组中ERV古病毒程序性复活、触发细胞老化、借助病毒颗粒传递衰老信号、感染年轻细胞的全链条机制。进一步，通过对ERV古病毒潜伏、复活、细胞间传递等不同生命周期环节的解析，研究人员开发出有效抑制ERV古病毒复活及清除病毒颗粒的干预策略，即通过发展基于靶向ERV调控元件的CRISPR基因沉默体系、靶向逆转录酶的小分子抑制药物、靶向病毒包膜蛋白的中和抗体等技术，阻断ERV的转录、反转录、病毒级联感染等多个环节，进而实现了组织和机体衰老的延缓。　　该研究系统定义并揭示了衰老诱导的内源性逆转录病毒复活（aging-induced resurrection of endogenous retrovirus, AIR-ERV）可以作为细胞、器官乃至机体衰老的驱动力及度量标志物，为衰老的程序化、级联放大和可干预性提供了全新的理论依据，为人类衰老的科学评估和预警、衰老及衰老相关疾病的防治提供了重要的线索和思路。在理论方面，研究创造性地提出了衰老的程序化、跨细胞传递及可干预性，将ERV古病毒的复活确证为新的衰老时钟和驱动因素；在技术方面，研究综合运用多维表观基因组、转录靶向操控、单分子成像、病毒学、免疫学、化学生物学和分子病理学等前沿交叉技术动态捕获了ERV古病毒的复活、包装、颗粒化、跨细胞传递和激活天然免疫通路等多个生物学过程，成功刻画了ERV在衰老机体中的生命周期轨迹，开创了新的衰老研究范式；在转化医学方面，研究以ERV古病毒复活链条的不同环节为靶标发展出多样化的衰老干预技术，为衰老相关疾病的防治提供了新的策略，对衰老转化医学领域具有潜在的应用价值。　　综上，该研究提示病毒密码在远古时代便已融入人类的衰老及寿命调控程序，解码基因组中的古病毒元素将有助于深刻理解人类衰老的机制、健康长寿的规律以及多种老年疾病的诱因。ERV古病毒的复活或许为认识衰老的“潘多拉魔盒”提供了一条崭新的路径。“魔盒”的开启为理解衰老规律开辟了新的科学疆域，更为防治老年疾病带来新的希望。未来围绕着衰老伴随的ERV古病毒激活，将会涌现出更多的科学问题，例如：ERV反转录本是否可以重新整合入宿主基因组，进而介导衰老相关的基因组不稳定性？ERV古病毒序列在人类基因组中是否具有遗传多态性？是否与老年健康密切相关？ERV的复活和感染效率是否具有组织和细胞类型特异性？ERV激活是否会选择性驱动特定衰老相关疾病的发生？体液中ERV检测能否应用于衰老和老年疾病的评估和预警？针对ERV生命周期的哪些靶向策略对于临床的衰老和疾病干预最为有效？期待在科学研究不断深入和技术手段日益革新的将来，这些谜题可得以逐一解决。　　该研究由中国科学院动物研究所、中国科学院北京基因组研究所、中国科学院遗传与发育研究所、北京干细胞与再生医学研究院、首都医科大学宣武医院、昆明理工大学、华中农业大学、北京大学和北京医院等多家机构合作完成。中国科学院动物研究所刘光慧研究员、曲静研究员及中国科学院北京基因组研究所张维绮研究员为文章的共同通讯作者。中国科学院动物研究所助理研究员刘晓倩、博士研究生刘尊鹏、特别研究助理武泽明和中国科学院北京基因组研究所研究员任捷为文章的并列第一作者。研究得到周琪院士、季维智院士、曹罡教授、牛昱宇教授、汤富酬教授、孙亮教授、王思研究员、张勇研究员、宋默识研究员、陆发隆研究员和郑爱华研究员的合作与支持，同时获得科技部、国家自然科学基金委、中国科学院和北京市等项目的资助。　　原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.017图1. HERVK 病毒RNA (左图) 和病毒颗粒（RVLP，右图) 在衰老人类细胞中聚集图2. 内源性古病毒复活驱动衰老的机制与干预策略图3. 内源性古病毒复活驱动开启衰老“潘多拉魔盒”

2023-01-07

郭帆/王红梅团队解析小鼠早期胚胎和生殖细胞发育过程中DNA羟甲基化概观及其调控

2022年12月20日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院郭帆和王红梅团队合作（中国科学院动物研究所博士生燕蕊、联合培养研究生程馨、博士生徐艳红、博士生龙鑫和北京昌平实验室副研究员古婵为本文共同第一作者），在Nature Genetics发表了题为Dynamics of DNA hydroxymethylation and methylation during mouse embryonic and germline development的研究论文。研究者对小鼠配子、受精后的着床前胚胎、着床后胚胎和原始生殖细胞以及体外培养胚胎进行了全基因组5hmC的测序分析，通过分离受精卵中的雌雄原核，定量解析了Tet3和DNA复制对于5hmC产生的影响。此外，研究者通过追踪父母本基因组，进一步揭示了父本和母本基因组之间在5hmC的产生以及分布上的异同。更进一步，研究者还发现了一个影响早期胚胎DNA甲基化重编程和5hmC累积的新因子，并利用敲除小鼠模型结合化学小分子抑制剂进行了深入解析，为胚胎和生殖细胞发育过程中5hmC的调控和功能提供了新的机制见解。
　　长期以来，DNA甲基化（5mC）作为哺乳动物中最为经典的DNA共价修饰被广泛研究，其对基因表达调控、转座子沉默、基因印记以及X染色体失活等生命过程至关重要。直到2009年，Anjana Rao实验室在Science首次报道了在哺乳动物细胞中，存在由一类DNA双加氧酶Tet1/2/3介导的基于5mC氧化而产生的新的DNA共价修饰——DNA羟甲基化（5hmC）1；随后，关于5hmC的生物学功能及其意义成为表观遗传学领域有待回答的重大科学问题之一。经过领域内十余年的研究，目前关于5hmC的生物学功能主要存在两种观点：一是5hmC会介导DNA的主动去甲基化，从而产生新的未经修饰的胞嘧啶。体外支持证据来自2011年徐国良教授和张毅教授实验室分别背靠背发表于Science上的研究论文2,3；体内支持证据则是领域内代表性的几个实验室各自独立发现Tet蛋白介导的5mC氧化参与小鼠受精卵和原始生殖细胞（PGC）中DNA甲基化的擦除4。二是5hmC自身也可以介导特定蛋白与DNA的结合或者去结合，例如转录因子或者甲基化CpG结合蛋白等，从而参与调控基因的表达。代表性证据最早来自于Michiel Vermeulen实验室2013年发表在Cell的研究论文，通过定量质谱的蛋白质组学技术在小鼠胚胎干细胞（mESC）、神经元祖细胞（NPC）和成年小鼠脑组织中鉴定出了与5hmC结合或亲和结合5mC的特定蛋白5。
　　通过定量质谱以及全基因组5hmC测序，人们鉴定出了在胚胎干细胞、神经元祖细胞和成年脑组织中5hmC的水平以及基因组分布6，为研究5hmC的生物学功能迈出了关键的一步。近年来，对于DNA甲基化以及部分组蛋白修饰在早期胚胎中的分布与作用已有连续报道7，使得人们对于早期胚胎发育过程中的关键事件如合子基因组激活和全能性的建立获得了新的认知。然而，关于5hmC在胚胎发育中的功能，过去的研究手段局限于细胞免疫荧光染色，缺乏对该修饰在基因组中分布的细节刻画，使得对于胚胎中5hmC的产生以及作用仍存在较大争议。备受关注的争论之一是受精卵中产生的5hmC是发生在DNA去甲基化区域，还是从头或维持DNA甲基化产生的区域（Rachel Amouroux, et al., Nat. Cell. Biol., 2016）8；其次，尽管5hmC信号在着床前胚胎中会伴随着DNA的复制而被逐步稀释，是否仍有稳定的5hmC位点存在？其在基因组上的分布与基因表达的关系如何？最后，虽然已知Tet3蛋白介导受精卵中5hmC的产生，其它影响DNA甲基化重编程和5hmC累积的因子仍知之甚少。这些问题不仅限制了人们对5hmC在发育过程中功能机制的研究，也影响着DNA甲基化重编程如何发生——这一表观遗传学领域根本问题的结论。
　　2022年12月20日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院郭帆和王红梅团队合作（中国科学院动物研究所博士生燕蕊、联合培养研究生程馨、博士生徐艳红、博士生龙鑫和北京昌平实验室副研究员古婵为本文共同第一作者），在Nature Genetics发表了题为Dynamics of DNA hydroxymethylation and methylation during mouse embryonic and germline development的研究论文。研究者对小鼠配子、受精后的着床前胚胎、着床后胚胎和原始生殖细胞以及体外培养胚胎进行了全基因组5hmC的测序分析，通过分离受精卵中的雌雄原核，定量解析了Tet3和DNA复制对于5hmC产生的影响。此外，研究者通过追踪父母本基因组，进一步揭示了父本和母本基因组之间在5hmC的产生以及分布上的异同。更进一步，研究者还发现了一个影响早期胚胎DNA甲基化重编程和5hmC累积的新因子，并利用敲除小鼠模型结合化学小分子抑制剂进行了深入解析，为胚胎和生殖细胞发育过程中5hmC的调控和功能提供了新的机制见解。
　　研究者发现在早期胚胎及生殖细胞发育过程中会经历两次全基因组范围5hmC的产生（图1），第一次发生于受精卵中，偏好性的累积在父本基因组上，并持续到二细胞期而在随后的卵裂过程中被逐渐稀释，直至囊胚期到达最低点；第二次发生于着床后E6.5天胚胎的上胚层细胞（epiblast）中，对称产生在父母本基因组中，在E9.5天的PGC中仍维持较高水平，而在随后阶段逐渐降低直至E13.5天达至最低点。其中，受精卵中产生的5hmC会富集在发生DNA去甲基化的位点，而不是维持性DNA甲基化或从头甲基化位点，这为5hmC可作为去甲基化的中间物提供了最为直接的体内证据。着床后胚胎中产生的5hmC则会定位于发生从头DNA甲基化的位点，高度富集于增强子（enhancer）中，在PGC发生DNA去甲基化时逐渐减少。虽然Tet3主导了受精卵中5hmC的产生，DNA复制也会影响5hmC的生成，尤其是母本基因组受DNA复制的影响更高。生殖细胞中建立的DNA甲基化印记位点会在着床前胚胎中继续维持，而在PGC阶段发生甲基化擦除。研究者发现这些印记位点在epiblast或PGC中会有较高水平的5hmC，令人意外的是在受精卵中印记位点上也有显著水平的5hmC产生。受精后产生的5hmC是否存在可以稳定维持的位点？研究者发现绝大部分位点会伴随着胚胎发育进程而逐渐丢失5hmC，然而仍有极少数位点可以维持显著水平的5hmC直至囊胚期；这些位点对应的基因在母本基因组中从卵细胞开始一直表达，而在父本基因组中则是从二细胞起始表达。
　　5hmC除了可以介导DNA去甲基化，是否还有其它作用？研究者发现受精后父本基因组产生的5hmC区域与合子基因组激活基因高度重合，分布于基因的启动子（promoter）、增强子和基因体（gene body）中。特定转录因子结合位点也显示出5hmC的富集（图2），Zfp57、Arntl和Ehf结合位点在卵母细胞和着床前胚胎的父母本基因组中有5hmC的富集。其中，Zfp57已被报道在小鼠早期胚胎中将DNMTs招募到其目标位点，参与印记基因甲基化的维持。Runx2, Nfil3, Thrb, Ebf1和Atf1/2结合位点在着床前胚胎的父本基因组中显著富集5hmC。参与小鼠原肠胚形成或早期胚胎器官发生的转录因子如Otx2、T、Pou5f1、Nanog、Sox2、Zic2/3和Myc在E6.5天胚胎的epiblast中也显示出其结合位点富含5hmC。生殖细胞特异的转录因子如Prdm14、Zfx、Zbtb33、Prdm9和Tcf21，其结合位点在PGC中也高度富集5hmC，这些因子已被报道在生殖细胞发育或减数分裂中发挥重要作用。进一步地，研究者分析了5hmC与特定组蛋白修饰之间的关联（图2）。受精之后，H3K4me3和H3K36me3修饰区域会富集5hmC，而H3K9me3和H3K27me3修饰位点通常会排斥5hmC的产生。卵母细胞中H3K9me2修饰区域通常与DNA高甲基化区域在空间上分离，并且从免疫荧光染色的结果推断，受精后母本基因组中H3K9me2修饰会抵抗5hmC的产生。研究者发现卵母细胞中H3K9me2修饰区域在受精后的确会排斥5hmC的产生，但仍有极少数位点会含有较高水平的5hmC。
　　小鼠体外培养胚胎（IVC embryos）是研究胚胎着床后形态发生和分子事件的替代模型9，其基因组中5hmC的产生与分布跟体内发育胚胎相比有何差异？研究者发现IVC胚胎总体上可以正常发生从头DNA甲基化以及基因组范围5hmC的生成，然而在一些高度富集5hmC且与胚胎形态发生和细胞分化相关联的基因位点，IVC胚胎则显示出5hmC产生不足并有着更高水平的DNA甲基化，相关基因的表达也会显著降低（图3）。这些结果表明，5hmC参与调控了E6.5天epiblast中相应基因的表达，并且IVC胚胎中特定基因位点5hmC水平降低可能与其体外发育受限相关。
　　除了Tet蛋白，还有哪些因子可能会影响早期胚胎中5hmC的产生和累积？在人类中，多位点印记基因疾病（MLID）与NLRP家族基因的母源突变以及DNA甲基化异常相关10。大多数人类NLRP基因在小鼠中也具有同源基因，并且Nlrp基因敲除的雌鼠通常显示出受精后着床前胚胎发育阻滞，导致不育或生育力降低。有趣的是，Nlrp KO雄鼠生育力则不受影响。研究者根据这些现象提出了一个问题，即母源缺失Nlrp是否会影响早期胚胎的DNA甲基化重编程。然而，关于NLRP基因与异常DNA甲基化之间关联的机制却鲜有文献报道，特别是在通过利用母源缺失Nlrp的小鼠来追踪异常DNA甲基化的起源方面。研究者首先系统分析了小鼠从卵细胞至早期胚胎中所有Nlrp基因的表达，发现除了已被报道的Nlrp5外，Nlrp14也高表达于卵细胞中并呈现出明显的母源表达模式。利用Nlrp14 KO的小鼠模型，研究者进行了更加深入的分析（图4）。同Nlrp5 KO小鼠类似，Nlrp14 KO雄鼠可正常生育，而KO雌鼠受精后表现为着床前胚胎发育阻滞，导致雌性不育。更进一步，研究者发现母源缺失Nlrp14的受精卵中维持性DNA甲基化酶Dnmt1及其辅因子Uhrf1会由细胞质定位转变为细胞核定位，阻碍了DNA复制关联的DNA被动去甲基化的发生，导致父本基因组DNA甲基化水平显著高于正常胚胎。此外，Nlrp14母源KO的胚胎还表现出全基因组染色质开放程度显著降低以及合子基因组激活受阻。受精卵中因Nlrp14缺失使得Dnmt1的活性增强，对5hmC的产生会有怎样的影响？研究者发现Nlrp14缺失的早期胚胎中5hmC水平显著降低，尤其是在原本会发生DNA去甲基化的区域。这一实验证据也再次表明Tet3介导的5hmC产生与DNA去甲基化紧密关联，而不是偏好性地发生在维持性DNA甲基化区域。
　　最后，研究者继续探索了Nlrp14是否会影响PGC中DNA甲基化重编程以及配子中DNA甲基化的建立。研究者发现Nlrp14 KO的胚胎中，PGC的发育正常且相关特征基因的表达也不受影响。同时，Nlrp14 KO的PGC中全基因组DNA甲基化的擦除亦无异常。在Nlrp14 KO后，精子和卵细胞也可以正常建立DNA甲基化，并且精子和卵子发生均无明显异常。这些结果共同表明Nlrp特异性地参与了受精卵中DNA甲基化重编程并影响Tet3介导的5hmC产生。
　　综上，该研究系统性地揭示了从小鼠早期胚胎发育至生殖细胞发生过程中5hmC的全基因组分布与分子调控特征，提出了早期胚胎DNA甲基化重编程的新模式（图5）。该研究不仅为表观遗传领域长期以来的重大争议问题提供了有力的实验论证，也为深入理解早期胚胎发育过程中的表观遗传调控开启了新维度。
　　文章链接：https://www.nature.com/articles/s41588-022-01258-x
　　参考文献
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　　6. Wu, H. & Zhang, Y. Charting oxidized methylcytosines at base resolution. Nat Struct Mol Biol 22, 656-61 (2015).
　　7. Du, Z., Zhang, K. & Xie, W. Epigenetic Reprogramming in Early Animal Development. Cold Spring Harb Perspect Biol 14(2022).
　　8. Amouroux, R. et al. De novo DNA methylation drives 5hmC accumulation in mouse zygotes. Nat Cell Biol 18, 225-233 (2016).
　　9. Shahbazi, M.N., Siggia, E.D. & Zernicka-Goetz, M. Self-organization of stem cells into embryos: A window on early mammalian development. Science 364, 948-951 (2019).
　　10. Begemann, M. et al. Maternal variants in NLRP and other maternal effect proteins are associated with multilocus imprinting disturbance in offspring. J Med Genet 55, 497-504 (2018).
　　图1. 小鼠早期胚胎及生殖细胞中5hmC概观
　　图2. 特定转录因子和组蛋白修饰与5hmC的关联
　　图3. IVC胚胎与体内发育胚胎的5hmC水平比较
　　图4. Nlrp14参与早期胚胎DNA甲基化重编程并影响5hmC的累积
　　图5. 早期胚胎中5hmC产生以及DNA甲基化重编程模式
　　

2022-12-20

王红梅/郭帆/吴军/蒋祥祥团队绘制灵长类胚胎原肠运动至早期器官发育转录组图谱

2022年12月14日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院王红梅和郭帆团队、美国德克萨斯大学西南医学中心吴军团队以及安徽医科大学蒋祥祥团队合作（中国科学院动物研究所博士后翟晶磊、博士生郭敬、助理研究员万海峰、博士生齐鲁青和德克萨斯大学西南医学中心的博士后刘立中为本文共同第一作者）在Nature上发表了文章Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution[7]。研究者以食蟹猴为模型，利用单细胞转录组测序和干细胞分化模型等，绘制了食蟹猴CS8-CS11时期（E20-E29）胚胎的单细胞转录组图谱，揭示了原肠运动和三胚层分化（神经管、体节、肠管等的发育）过程中重要细胞类群的特征及其谱系发生和调控机制，并比较了啮齿类和灵长类早期胚胎发育事件的进化差异。
　　人的生命开始于精子与卵子融合形成受精卵（胚胎期第0天；Embryonic day 0；E0），受精卵经历卵裂形成囊胚，囊胚在E7左右种植到母体子宫进一步发育。E14开始，胚胎经历原肠运动，胚胎后部细胞发生大规模定向迁移，并形成原条细胞。原条细胞进一步分化为中胚层和定型内胚层（definitive endoderm），同时胚胎前部细胞分化为外胚层。基于此，胚胎发育成为具有内胚层、中胚层和外胚层的三胚层胚胎。经过复杂的信号通路调控，三胚层胚胎进一步形成各种器官原基，并最终形成我们身体中包括神经系统、消化系统、呼吸系统、心血管循环系统、泌尿生殖系统等所有系统的各种器官。原肠运动和三胚层分化异常与多种出生缺陷（如先天性心脏病和神经管畸形等）和发育源性疾病相关。了解人类早期胚胎发育过程及其机制对于这些疾病的诊断和治疗至关重要。为了精准地描述不同发育时期人类胚胎特征并进行物种间胚胎发育比较，自上世纪早期来自美国卡耐基研究所的Franklin Mall等人将人类胚胎发育的前60天（E0-E60）划分为23个发育时期，即Carnegie stage（CS1-CS23）[1]。目前，通过体外胚胎培养等方法，人类CS1-CS6（E0-E14）胚胎发育事件已被多个团队解析[2-5]；借助一枚宝贵的在体胚胎，人类CS7胚胎的关键发育事件（原肠运动等）也开始被阐明[6]，然而，由于临床诊疗规范限制，人CS8-11的正常胚胎极难获得，所以在此阶段发生的中晚期原肠运动和早期器官发育事件相关研究仍为空白。非人灵长类（如食蟹猴）在进化、生理特征及胚胎发育方面与人类高度类似，可作为研究人类早期胚胎发育的替代模型。由于人类早期胚胎难于获得，一些人类早期胚胎上难以回答的问题可借助非人灵长类胚胎实现。
　　2022年12月14日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院王红梅和郭帆团队、美国德克萨斯大学西南医学中心吴军团队以及安徽医科大学蒋祥祥团队合作（中国科学院动物研究所博士后翟晶磊、博士生郭敬、助理研究员万海峰、博士生齐鲁青和德克萨斯大学西南医学中心的博士后刘立中为本文共同第一作者）在Nature上发表了文章Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution[7]。研究者以食蟹猴为模型，利用单细胞转录组测序和干细胞分化模型等，绘制了食蟹猴CS8-CS11时期（E20-E29）胚胎的单细胞转录组图谱，揭示了原肠运动和三胚层分化（神经管、体节、肠管等的发育）过程中重要细胞类群的特征及其谱系发生和调控机制，并比较了啮齿类和灵长类早期胚胎发育事件的进化差异。
　　研究者收集了CS8-CS11阶段的食蟹猴胚胎，利用10X单细胞转录组测序技术捕获了56636个单细胞并进行生物信息学分析，明确定义了食蟹猴该时期的38个主要细胞类群，绘制了目前国际上第一张灵长类CS8-CS11胚胎的高通量单细胞转录组图谱（图1）。
　　啮齿类动物（小鼠）原肠运动阶段的胚胎三胚层细胞分化过程已有相对全面清晰的描述，但在灵长类动物上的研究仍非常有限。为了研究灵长类原肠运动阶段胚胎三胚层细胞分化的精细过程，研究者通过RNA轨迹分析描绘了原条细胞的三向分化潜能，分别为初始中胚层（nascent mesoderm）、定型内胚层和原结（node）。其中，初始中胚层可进一步分化为神经中胚层祖细胞（neuromesoderm progenitor, NMP）、前体节中胚层（presomite mesoderm, PSM）、轴旁中胚层（paraxial mesoderm）、中间中胚层（intermediate mesoderm）、侧板中胚层（lateral plate mesoderm）、生心中胚层（cardiac mesoderm）和胚外中胚层（extraembryonic mesoderm）等细胞类型；定型内胚层与原肠运动之前形成的脏壁内胚层（visceral endoderm）共同贡献于肠管（gut tube）的形成；原结进一步参与轴正中中胚层（axial mesoderm）的形成。此外，研究者基于生物信息学分析推测，由外胚层分化而来的神经管前后不对称和背腹不对称的发育模式是由WNT、SHH和TGB-β等信号在胚胎前后轴和背腹轴的不对称表达所介导的。
　　哺乳动物早期胚胎发育过程在进化上高度保守，但不同物种哺乳动物的早期胚胎发育过程仍存在特异的分子特征。研究者全面比较了相同发育阶段的小鼠和食蟹猴胚胎的转录组差异（图3），揭示了两物种胚胎中对应细胞类型的分化调控异同。研究发现，T、EOMES和TBX6基因在小鼠和食蟹猴的原条、初始中胚层、神经中胚层祖细胞和外胚层细胞中的表达模式不同。此外，与小鼠相比，Hippo信号通路的多个下游基因在食蟹猴的NMP/PSM中被显著上调。为深入研究Hippo信号通路在灵长类动物与啮齿类动物NMP/PSM形成过程中的不同作用，研究者构建了人、猴和小鼠胚胎干细胞诱导产生的NMP/PSM体外模型，通过添加抑制剂等实验，发现Hippo信号通路在灵长类NMP/PSM细胞仍保持高度活化状态，而在小鼠NMP/PSM细胞中被抑制（图3）。由此推测Hippo信号通路在人和猴NMP/PSM细胞中的高度活化状态可能与灵长类胚胎体轴更长、胚胎体积更大及发育周期更长等体征密切相关。
　　基于干细胞的人类胚胎模型（类胚胎）对于研究人胚胎早期发育研究至关重要。近年来，类原肠胚[8,9]、类神经胚[10-13]、心脏类器官[14]以及类体节[15]模型相继构建成功。然而，由于缺乏灵长类动物体内相应时期胚胎的发育数据，这些胚胎模型对在体真实胚胎的模拟程度无法被直接证实。本研究填补了这一空白，为未来相应时期胚胎模型的构建提供了在体的比对数据。并且，研究者利用这一在体数据，初步研究了上述胚胎模型与在体胚胎的相似度，发现上述胚胎模型在细胞类型方面与在体胚胎存在一定相似性，但在关键信号通路激活程度、转录因子表达等多方面与在体胚胎存在差异。
　　综上所述，本研究揭示了灵长类动物原肠运动至早期器官发育阶段胚胎的细胞组分与分子特征、细胞谱系发生过程及分子调控机制。该研究不仅填补了灵长类胚胎原肠运动至早期器官发育阶段的领域知识空白，而且为人类胚胎模型的研究提供了必要的在体数据参考，为深入了解人类早期胚胎发育过程的调控机理以及发育异常相关疾病的病理奠定坚实基础。
　　原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-05526-y
　　参考文献：
　　1. O’Rahilly, R. & Müller, F. Developmental stages in human embryos : including a revision of Streeter’s. In: "Horizons" and a Survey of the Carnegie Collection. Section1, Page 2-3. (Carnegie Institution of Washington, 1987)
　　2. Deglincerti, A., Croft, G. F., Pietila, L. N., Zernicka-Goetz, M., Siggia, E. D., & Brivanlou, A. H. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature 533, 251-254 (2016)
　　3. Shahbazi, M. N., Jedrusik, A., Vuoristo, S., Recher, G., Hupalowska, A., Bolton, V., Fogarty, N. N. M., Campbell, A., Devito, L., Ilic, D., Khalaf, Y., Niakan, K. K., Fishel, S., & Zernicka-Goetz, M. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nat Cell Biol. 18, 700-708 (2016)
　　4. Xiang, L., Yin, Y., Zheng, Y., Ma, Y., Li, Y., Zhao, Z., Guo, J., Ai, Z., Niu, Y., Duan, K., He, J., Ren, S., Wu, D., Bai, Y., Shang, Z., Dai, X., Ji, W., & Li, T. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature 577, 537-542 (2020)
　　5. Zhou, F., Wang, R., Yuan, P., Ren, Y., Mao, Y., Li, R., Lian, Y., Li, J., Wen, L., Yan, L., Qiao, J., & Tang, F. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature, 572, 660-664 (2019)
　　6. Tyser, R. C. V., Mahammadov, E., Nakanoh, S., Vallier, L., Scialdone, A., & Srinivas, S. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature 600, 285-289 (2021)
　　7. Primate gastrulation and early organogenesis at single-cell resolution (Prepare for publication)
　　8. Minn, K. T. et al. High-resolution transcriptional and morphogenetic profiling of cells from micropatterned human ESC gastruloid cul tures. eLife 9, e59445 (2020).
　　9. Minn, K. T., Dietmann, S., Waye, S. E., Morris, S. A. & Solnica-Krezel, L. Gene expression dynamics underlying cell fate emergence in 2D micropatterned human embryonic stem cell gastruloids. Stem Cell Rep. 16, 1210–1227 (2021).
　　10. Rifes, P. et al. Modeling neural tube development by differentiation of human embryonic stem cells in a microfluidic WNT gradient. Nat. Biotechnol. 38, 1265–1273 (2020).
　　11. Haremaki, T. et al. Self-organizing neuruloids model developmental aspects of Huntington’s disease in the ectodermal compartment. Nat. Biotechnol. 37, 1198–1208 (2019).
　　12. Karzbrun, E. et al. Human neural tube morphogenesis in vitro by geometric constraints. Nature 599, 268–272 (2021).
　　13. De Santis, R., Etoc, F., Rosado-Olivieri, E. A. & Brivanlou, A. H. Self-organization of human dorsal-ventral forebrain structures by li ght induced SHH. Nat. Commun. 12, 6768 (2021).
　　14. Drakhlis, L. et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat. Biotechnol. 39, 737–746 (2021).
　　15. Sanaki-Matsumiya, M. et al. Periodic formation of epithelial somites from human pluripotent stem cells. Nat. Commun. 13, 2325 (2022).
　　图1. CS8-CS11时期食蟹猴胚胎的明场图（左）与38种主要细胞类群（右）
　　图2. E22胚胎原条及其衍生物细胞类型分布示意图与免疫荧光图
　　图3. Hippo信号通路在灵长类与啮齿类NMP/PSM细胞的活化程度差异。
　　食蟹猴和小鼠Hippo信号通路差异基因表达模式（左）；抑制Hippo信号通路对人、猴和小鼠PSM中YAP1分子表达的影响（中）及对人、猴、小鼠PSM分化的影响（右）。
　　

2022-12-14

焦建伟研究组揭示人类特异基因促进大脑皮层折叠新机制

2022年11月22日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院焦建伟研究组在Cell Discovery 杂志上发表了题为Human SERPINA3 induces neocortical folding and improves cognitive ability in mice的研究论文。这项研究发现人源基因SERPINA3促进了小鼠皮层的扩张和折叠的产生，增加了上层神经元的数量，并且明显改善了小鼠的认知能力。
　　在人类进化过程中，新皮层的扩张与智力的提高和认知功能的改善密切相关。这种扩张的一个关键方面是大脑皮层沟回的形成，它使扩张的皮质表面积能够适应有限的颅骨空间。这些进化特征主要依赖于多种神经干细胞和祖细胞亚型及其神经源性分裂产生的更多数量的皮层神经元。近年来，许多研究都揭示了外放射状胶质细胞（oRG）与大脑皮层沟回形成有重要的联系，一是因为oRG作为人脑中大量存在的神经前体细胞，增加了神经祖细胞的种类和数量，二是oRG给神经元提供了更多的径向迁移的路径，从而促进皮层的扩张及沟回的形成。然而，大脑皮层折叠的分子和细胞机制仍然知之甚少。
　　2022年11月22日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院焦建伟研究组在Cell Discovery 杂志上发表了题为Human SERPINA3 induces neocortical folding and improves cognitive ability in mice的研究论文。这项研究发现人源基因SERPINA3促进了小鼠皮层的扩张和折叠的产生，增加了上层神经元的数量，并且明显改善了小鼠的认知能力。
　　研究首先构建了条件性敲入小鼠（cKI），在神经系统中过表达SERPINA3，结果发现SERPINA3能促进神经发育过程中小鼠大脑的神经干细胞的增殖以及oRG的产生。cKI小鼠出生后表现出大脑皮层表面积变大、皮层增厚的现象，以及沟回结构的形成。对新生小鼠的大脑皮层进行单细胞测序分析，进一步证明SERPINA3过表达增加了上层神经元的输出。成年后的cKI小鼠和野生型相比，在行为学实验中表现出更强的学习和记忆能力。
　　研究通过转录组测序还发现SERPINA3通过结合下游靶基因Glo1的promoter来调节其表达。Glo1作为调节丙酮醛代谢的关键因子，其表达上调后加速了丙酮醛的代谢，进而促进神经祖细胞的增殖和大脑皮层的扩张和折叠。
　　综上所述，该研究不仅揭示了SERPINA3对神经干细胞增殖能力及丰度的重要作用，也阐明了大脑皮层扩张以及折叠的一种新的分子机制。
　　中国科学院动物研究所焦建伟研究员为论文通讯作者，博士研究生赵津悦、冯超为论文共同第一作者。该研究得到了科技部、国家自然科学基金委、科学院先导等项目的资助。
　　原文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-022-00469-0
　　图. SERPINA3在大脑皮层扩张和折叠中的作用模式图
　　

2022-11-22

干细胞院合作揭示延缓人类骨骼肌衰老的新靶标

2022年11月22日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、曲静研究组，首都医科大学宣武医院王思课题组以及中国科学院北京基因组研究所张维绮课题组合作，在Protein & Cell杂志在线发表题为“Single-nucleus profiling unveils a geroprotective role of the FOXO3 in primate skeletal muscle aging”的研究论文。该研究通过系统解析灵长类骨骼肌的衰老表型并绘制单细胞核转录组图谱，揭示了FOXO3作为维持骨骼肌稳态的枢纽转录因子，在拮抗人类骨骼肌衰老中发挥关键作用，为进一步开发针对骨骼肌衰老的诊断和干预策略提供了理论基础。
　　骨骼肌是执行机体运动功能的主要组织器官之一。与衰老相关的骨骼肌质量和功能减退被称为肌肉减少症（Sarcopenia，肌少症），这种疾病将导致老年人运动能力、平衡能力等身体机能的显著下降，进而增加虚弱、跌倒、残疾甚至死亡的风险。此外，骨骼肌分泌的肌源因子会对全身产生系统性影响，对于维持机体的稳态和健康具有重要作用。因此，深入了解骨骼肌稳态维持及衰老驱动的机制具有重要的科学和临床意义。然而，由于骨骼肌组织结构的复杂性和肌纤维组成的异质性，传统的研究手段难以揭示骨骼肌中多核肌纤维细胞的特征性变化，目前人们对骨骼肌衰老的机制的认识还十分有限，也阻碍了相关干预手段的开发。
　　2022年11月22日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、曲静研究组，首都医科大学宣武医院王思课题组以及中国科学院北京基因组研究所张维绮课题组合作，在Protein & Cell杂志在线发表题为“Single-nucleus profiling unveils a geroprotective role of the FOXO3 in primate skeletal muscle aging”的研究论文。该研究通过系统解析灵长类骨骼肌的衰老表型并绘制单细胞核转录组图谱，揭示了FOXO3作为维持骨骼肌稳态的枢纽转录因子，在拮抗人类骨骼肌衰老中发挥关键作用，为进一步开发针对骨骼肌衰老的诊断和干预策略提供了理论基础。
　　研究人员首先通过对年轻和年老的食蟹猴骨骼肌进行组织学分析，发现了骨骼肌衰老过程出现肌纤维萎缩、快肌减少、慢肌增多、肌肉干细胞减少、肌间脂质积累、神经肌肉接头受损、凋亡增加、核纤层加速丢失、核内异染色质损耗等一系列衰老特征。为了在单细胞分辨率解析灵长类骨骼肌衰老的细胞分子变化规律，研究人员进一步构建了食蟹猴骨骼肌衰老的单细胞核转录组图谱，系统揭示了骨骼肌组织中存在的14种细胞核类型，包括I型慢肌纤维、IIA型快肌纤维、IIX型快肌纤维、神经肌肉接头突触后肌纤维等4种来自多核肌纤维的细胞核，以及肌肉干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肌腱成纤维细胞、成纤维细胞/成纤维脂肪生成祖细胞、巨噬细胞等肌间质细胞。
　　尽管骨骼肌衰老过程中不同类型细胞的身份特征保持相对恒定，但特殊细胞群体的比例发生了变化，例如肌肉干细胞和内皮细胞的减少等。通过对转录噪音和衰老相关差异基因进行分析，发现骨骼肌纤维对衰老具有更高的易感性，主要反映为肌纤维具有较高的转录噪音以及衰老相关差异表达的基因。进一步分析发现，FOXO3在衰老的多种细胞（包括肌纤维细胞）中均出现下调变化。与骨骼肌衰老相关退行疾病数据库的联合分析表明，FOXO3与多种骨骼肌退行性疾病密切相关。此外，研究人员构建了骨骼肌衰老的核心转录因子网络，也发现FOXO3在下调的转录调控网络中处于核心位置。进一步的实验证明了FOXO3在食蟹猴骨骼肌组织和人类骨骼肌样本中均呈现出增龄伴随的蛋白质水平下调，提示衰老过程中FOXO3蛋白的活力降低是灵长类骨骼肌衰老的共性特征。
　　为了深入探究FOXO3对人类骨骼肌衰老的潜在调控作用，研究人员建立了人多能干细胞定向诱导分化为肌管细胞的研究体系。研究发现，与衰老的人类骨骼肌组织类似，衰老的人肌管细胞中FOXO3的表达水平也发生下调。此外，敲低或敲除FOXO3的人肌管细胞也表现为一系列衰老相关表型，包括肌管直径减小和衰老标志物的增加。进而，研究人员通过基因编辑产生了内源FOXO3激活的遗传增强型人类肌管细胞，并证明了主动增加FOXO3的活力可显著延缓人类肌管细胞的衰老。
　　该研究首次绘制了灵长类骨骼肌衰老的单细胞核转录组图谱，系统解析了不同类型骨骼肌细胞随增龄发生的特异性分子变化规律；同时结合人类肌管衰老的研究体系，揭示了长寿蛋白FOXO3在拮抗人类骨骼肌衰老中的重要作用。这项研究为理解人类骨骼肌衰老的分子机制、诊断和治疗骨骼肌衰老及相关疾病提供了理论依据。
　　中国科学院动物研究所博士研究生经瑛、中国科学院北京基因组研究所硕士研究生左越晟、北京大学第三医院于洋研究员、北京医院/国家卫健委国家老年医学中心孙亮研究员、北京大学第一医院于峥嵘副主任医师为该论文的共同第一作者。中国科学院动物研究所刘光慧研究员、曲静研究员，首都医科大学宣武医院国家老年疾病临床医学研究中心王思研究员以及中国科学院北京基因组研究所张维绮研究员为共同通讯作者。该研究获得了科技部、国家自然科学基金委、中国科学院、北京市等项目的资助。
　　相关数据已上传至衰老多组学数据库Aging Atlas：https://ngdc.cncb.ac.cn/aging/index
　　原文链接：https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac061/6839274
　　图1. 灵长类骨骼肌衰老的表型和机制

2022-11-22

干细胞院合作揭示耳蜗衰老的细胞分子基础

2022年11月12日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、东南大学柴人杰课题组、首都医科大学宣武医院王思课题组以及中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院曲静研究组合作，在Protein & Cell杂志在线发表题为“Single-cell Transcriptomic Atlas of Mouse Cochlear Aging”的研究论文。该研究首次系统地绘制了小鼠耳蜗衰老的高分辨跨时序单细胞转录组图谱，揭示了增龄伴随的耳蜗功能减退的关键时间节点以及细胞分子调控机制，为发掘耳蜗衰老及相关退变的早期预警标志和潜在干预靶标提供了理论依据。
　　作为五大感觉器官之一，耳蜗能够感知外界的声波震动，将声音信号转换为电信号传递到大脑的颞叶形成听觉。随着年龄的增长，耳蜗的生理功能逐渐退化，从而导致老年性耳聋的发生，严重影响老年人的生活质量。解析耳蜗衰老的机制是理解并干预老年性耳聋的重要基础。然而，耳蜗结构精巧且复杂，由耳蜗柯蒂氏器、基底膜、蜗轴、血管纹、螺旋韧带等不同解剖区域组成，包含数十种细胞类型，传统方法难以精确揭示耳蜗衰老过程中不同细胞类型的衰老规律及分子调控网络。
　　2022年11月12日，中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院刘光慧研究组、东南大学柴人杰课题组、首都医科大学宣武医院王思课题组以及中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院曲静研究组合作，在Protein & Cell杂志在线发表题为“Single-cell Transcriptomic Atlas of Mouse Cochlear Aging”的研究论文。该研究首次系统地绘制了小鼠耳蜗衰老的高分辨跨时序单细胞转录组图谱，揭示了增龄伴随的耳蜗功能减退的关键时间节点以及细胞分子调控机制，为发掘耳蜗衰老及相关退变的早期预警标志和潜在干预靶标提供了理论依据。
　　在该项研究中，研究人员分别获取了1、2、5、12、15月龄C57BL/6J小鼠的耳蜗组织，通过听力功能检测发现：随着月龄增加，C57BL/6J小鼠表现出高频听力丢失的特征，这与人类老年性耳聋的特征较为相似。进一步的组织学分析发现，耳蜗衰老的特征表现为：内毛细胞、外毛细胞、螺旋神经元和螺旋韧带区域的纤维细胞等重要细胞类型均发生了不同程度的丢失，以及衰老相关的血管纹萎缩等。为明确小鼠耳蜗衰老过程中的细胞和分子变化规律，研究人员利用高通量单细胞转录组测序技术，系统地揭示了耳蜗柯蒂氏器、基底膜、蜗轴、血管纹、螺旋韧带等区域，包括毛细胞(Hair cell, HC)、螺旋神经元(Spiral ganglion neuron, SGN)、血管纹中层细胞(Intermediate cell, IC)等在内的27种耳蜗细胞类型衰老伴随的基因表达特征。
　　研究发现，耳蜗细胞的转录噪音随着增龄而升高，表明衰老导致耳蜗细胞RNA表达的不稳定性增加。其中，血管纹中层细胞转录噪音的增加尤为显著。为了确定耳蜗衰老的时间规律，研究人员通过不同时间点之间的配对比较分析，鉴定了特定时间点之间的差异基因（Pairwise differentially expressed genes，PDEGs），并发现5月龄时小鼠耳蜗已经展现出细胞衰老的转录谱特征。通过分析PDEGs的数量，发现血管纹中层细胞在衰老过程中表现出较多的基因表达差异。不同于时间点之间的两两比较，多个时间节点能够识别动态差异表达基因（Dynamic differentially expressed genes，DDEGs），以高分辨率的形式研究基因表达随时间的连续变化理论上更能揭示耳蜗衰老的跨时序变化规律。因此，研究人员进一步通过构建相应算法并鉴定出包括持续上调和持续下调等6种表达模式的DDEGs基因集，其中血管纹中层细胞拥有较多的持续上调和持续下调的差异表达基因。持续上调的基因主要与未折叠蛋白反应（UPR）、细胞凋亡、以及免疫炎性反应相关，持续下调的基因主要与离子转运、细胞基质黏附等相关，提示耳蜗衰老过程中伴随着细胞损伤的累积和功能下降。
　　研究人员进一步聚焦于血管纹中层细胞，通过对UPR通路的详细分析，发现UPR的三个主要分支通路（包括ATF6、IRE1和PERK信号通路）的相关基因的表达均随着衰老上调。一方面，UPR下游的应激代偿通路，包括内质网分子伴侣、内质网相关蛋白降解、NRF2等通路相关基因的表达随衰老而升高。另一方面，凋亡相关基因的表达也呈现出増龄伴随的上调。这些结果提示UPR代偿通路不足以抵消增龄伴随的持续的内质网应激，无法阻止耳蜗衰老相关损伤，进而引起中层细胞的凋亡。此外，研究发现血管纹中层细胞中UPR相关基因Hsp90aa1的上调最为明显，提示其可能作为耳蜗衰老相关损伤的潜在调控因子在中层细胞衰老中发挥作用。实验表明，在小鼠血管纹细胞中敲低Hsp90aa1可加剧细胞的UPR和凋亡程度，而激活Hsp90aa1可减轻应激压力下细胞内蛋白聚集并拮抗细胞凋亡。以上研究成果提示靶向Hsp90aa1-UPR通路可能为耳蜗衰老的干预提供新思路、新策略。
　　该研究首次报道了小鼠耳蜗衰老的跨多时间点的高分辨单细胞转录组景观图谱，系统地解析了耳蜗组织中多种细胞类型随衰老变化的规律，揭示了耳蜗衰老的新的分子特征。研究不仅加深了人们对耳蜗结构和功能增龄性退变的认识，阐明了耳蜗衰老过程的关键易感细胞类型及易感分子，且为评估耳蜗衰老程度及预警老年性耳聋提供了潜在的诊断生物标志物，为发展靶向耳蜗衰老的干预新策略奠定了理论基础。
　　中国科学院动物研究所刘光慧研究员、东南大学柴人杰教授、首都医科大学宣武医院王思研究员、中国科学院动物研究所曲静研究员为该论文共同通讯作者。中国科学院动物研究所博士研究生孙国强、郑彦东，东南大学付晓龙副教授，中国科学院北京基因组研究所张维绮、任捷研究员为该论文共同第一作者。研究获得了国家科技部、国家自然科学基金委、中国科学院等项目的资助。
　　相关数据已上传至衰老多组学数据库Aging Atlas (https://ngdc.cncb.ac.cn/aging/landscape?project=Mouse_Cochlea)。
　　原文链接：https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac058/6823876
　　图：小鼠耳蜗衰老的细胞分子机制

2022-11-12